Deciphering the Genetic and Genomic Architecture of Systemic Lupus Erythematosus

Titlu Proiect: Deciphering the Genetic and Genomic Architecture of Systemic Lupus Erythematosus

Număr contract: 760280/26.03.2024

Cod: 199/31.07.2023

Valoarea totală a proiectului este 6.131.326,45 RON, din care valoarea finanțării PNNR de 5.600.000 RON și TVA aferent de 531.326,45 RON.

Durata proiectului: 28 de luni (în perioada 26.03.2024-30.06.2026)

Director Proiect: Prof. dr. George Bertsias, University of Crete School of Medicine, Departament of Rheumatology and Clinical Immunology, Creta, Grecia

Cercetător postdoctoral (Responsabil proiect UMF): Asist. Univ. Dr. Pamfil Cristina, e-mail: cristinapamfil.umfcluj@gmail.com

Locatia de implementare : Universitatea de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu” Cluj- Napoca – Clinica Reumatologie Cluj-Napoca, strada Clinicilor nr. 2-4 și Catedra de Genetică Medicală, strada Pasteur nr. 6, Cluj-Napoca, România.

Sumar: Lupusul eritematos sistemic (LES) este o boală autoimună prototip care afectează multiple organe. În ciuda progreselor în înțelegerea bolii, pacienții se confruntă cu o morbiditate substanțială și o calitate redusă a vieții. Contribuția genetică joacă un rol important în LES, cu variante identificate în prezent, care explică <20% din ereditabilitatea. Mai mult decât atât, deși LES este caracterizat prin expresie și/sau bioactivitatea interferonului de tip I (IFN) crescută, esențială pentru inițierea și progresia bolii, factorii genetici pentru această perturbare și variabilitate inter-pacient rămân evazive. În special, semnătura IFN se corelează cu eficacitatea sporită a tratamentelor biologice, dar explicația moleculară de bază lipsește. Valorificând experiența noastră cu caracterizarea clinică, genetică și transcriptomică a LES, dorim să obținem informații suplimentare, prin integrarea genotipurilor, ARNm la nivelul genomului și transcriptoame de splicing alternativ, concentrându-ne pe calea IFN. În acest scop ne vom folosi de cohortele noastre existente de > 500 SLE și >300 de persoane sănătoase. În continuare, vom izola celulele dendritice plasmacitoide (producător principal de IFN) de la LES și subiecții sănătoși, pentru a fi supuse genotipării și analizei transcriptomului la starea nestimulată și după activare, permițând astfel identificarea unor loci de trăsătură cantitativă a expresiei specifice celulei (eQTL) care ar putea contribui la dereglarea IFN în SLE. În cele din urmă, vom analiza cohorta noastră de > 100 de pacienți cu LES sub tratament cu agentul biologic belimumab (mAb anti-BAFF), pentru a caracteriza interacțiunile eQTL in vivo cu starea IFN și blocarea BAFF. Rezultatele din studiile menționate mai sus vor fi confirmate funcțional cu teste de genetică funcțională în celulele imune primare relevante. În mod colectiv, cercetările noastre doresc a identifica cauze genetice ce pot explica producția aberantă de IFN în LES, cu implicații pentru stratificarea moleculară și clinică a bolii.

Scop general: Să obținem noi perspective asupra bazei genetice a LES prin integrarea variației genomului cu expresia genică.

Obiectivul proiectului
Obiectivul principal al proiectului este descifrarea arhitecturii genetice și genomice a lupusului eritematos sistemic, cu accent pe identificarea mecanismelor moleculare care controlează activarea căii interferonului de tip I, heterogenitatea bolii și răspunsul la terapiile biologice.
Proiectul urmărește integrarea datelor clinice, genetice, transcriptomice și funcționale pentru a identifica biomarkeri și semnături moleculare relevante pentru stratificarea pacienților cu lupus eritematos sistemic. În mod particular, proiectul investighează relația dintre variația genetică, expresia genică, splicingul alternativ, statusul interferon-high/interferon-low și răspunsul la tratamente biologice precum Belimumab și Anifrolumab.
Prin aceste activități, proiectul contribuie la dezvoltarea unei baze științifice pentru medicina personalizată în lupusul eritematos sistemic, prin identificarea unor mecanisme și biomarkeri care pot susține în viitor selecția mai precisă a tratamentului, monitorizarea răspunsului terapeutic și dezvoltarea unor strategii de intervenție adaptate profilului molecular al pacientului.

Obiective specifice:

Obiectiv 1 – Utilizarea unei cohorte existente de peste 400 de pacienți cu LES bine caracterizați și mai mult de 200 de indivizi sănătoși pentru a corela polimorfismele genetice cu expresia la nivelul genomului, inclusiv izoformele ARNm de splicing alternativ, care reprezintă o sursă semnificativă, insă subexplorată, de variație biologică.
Obiectiv 2 – Investigarea celulele dendritice plasmacitoide (pDC), producători semnificativi de interferoni, pentru a identifica loci de trăsături cantitative de expresie specifică celulei (eQTLs) în lupusul eritematos sistemic (LES) față de indivizii sănătoși, concentrându-se asupra celor asociate cu producția de
Obiectiv 3 – Studiul genotipurilor și profilurilor ARN ale unei cohorte mari de pacienți cu LES tratați cu agentul biologic Acest lucru va ajuta la caracterizarea interacțiunilor eQTL in vivo cu statusul IFN, și la evaluarea efectelor clinice și imunologice ale blocării BAFF.

Activități principale ale proiectului

Activitatea 1. Caracterizarea genetică, genomică și de splicing în lupusul eritematos sistemic
Această activitate urmărește caracterizarea clinică și biologică a pacienților cu lupus eritematos sistemic și integrarea datelor genetice cu date de expresie genică și splicing alternativ. Scopul este identificarea variantelor genetice asociate expresiei genice și evenimentelor de splicing, cu accent pe căile moleculare implicate în interferonul de tip I și în heterogenitatea bolii.
Au fost realizate activități de recrutare, colectare și biobancare a probelor biologice, precum și dezvoltarea fluxurilor bioinformatice pentru analiza datelor genetice și transcriptomice. Au fost utilizate și seturi de date publice de referință, incluzând două cohorte mari, cu 200 și respectiv 535 de probe, pentru dezvoltarea și testarea analizelor integrative eQTL și transcriptomice. Componenta de analiză a splicingului alternativ este în curs de finalizare și va constitui unul dintre rezultatele majore ale proiectului.

Activitatea 2. Caracterizarea răspunsului interferonic și a mecanismelor genetice care controlează producția de interferon de tip I
Această activitate urmărește investigarea răspunsului interferonic în lupusul eritematos sistemic, prin stimularea ex vivo a celulelor imune și analiza răspunsurilor moleculare și funcționale. În proiectul inițial, accentul era pus pe celulele dendritice plasmocitoide, principalii producători de interferon de tip I, iar în implementare au fost standardizate protocoale pe PBMC-uri, pentru a limita necesarul de sânge recoltat de la pacienți și pentru a permite aplicarea protocolului pe un număr mai mare de probe.
Au fost optimizate și standardizate protocoalele de stimulare ex vivo cu agoniști TLR7/TLR9, inclusiv Imiquimod și CpG ODN 2216, pentru caracterizarea răspunsului interferonic de tip I. A fost validată expresia genelor IFN-α, IFN-β și MX1 prin qPCR, iar experimentele au confirmat inducerea unui răspuns interferonic robust după stimulare. De asemenea, au fost pregătite probe biologice pentru analize ulterioare de tip RNA-seq și pentru determinarea interferonilor în supernatante stimulate.

Activitatea 3. Monitorizarea longitudinală a pacienților tratați cu terapii biologice și dezvoltarea direcției de medicină personalizată
Această activitate urmărește monitorizarea pacienților cu lupus eritematos sistemic aflați sub tratament biologic, în special Belimumab și Anifrolumab, pentru identificarea biomarkerilor genetici, transcriptomici și imunologici asociați răspunsului terapeutic. Obiectivul final este definirea unor semnături moleculare care pot contribui la stratificarea pacienților și la medicina personalizată în lupus.
Au fost recrutați și monitorizați longitudinal pacienți tratați cu Belimumab și Anifrolumab, cu recoltarea probelor biologice la momente succesive și colectarea datelor clinice relevante. În cadrul lotului Belimumab, pacienții monitorizați au prezentat ameliorare clinică, reducerea scorurilor de activitate și scăderea necesarului cortizonic. În cadrul lotului Anifrolumab, majoritatea pacienților evaluați au prezentat răspuns clinic favorabil, cu atingerea remisiunii sau a activității joase a bolii la trei luni și reducerea dozelor de corticosteroizi.

Activitatea 4. Management, achiziții, diseminare și dezvoltarea capacității instituționale
Această activitate include managementul proiectului, organizarea achizițiilor, monitorizarea implementării, recrutarea și formarea resursei umane, diseminarea rezultatelor și consolidarea capacității instituționale în domeniul cercetării multi-omics și imunologiei translaționale.
Au fost derulate activități de management, raportare, achiziții, recrutare de personal, participări la evenimente științifice și publicarea/diseminarea rezultatelor proiectului. De asemenea, instituția a obținut HR Excellence in Research Award la data de 12.02.2025, în contextul adoptării Cartei Europene a Cercetătorilor și a Codului de conduită pentru recrutarea cercetătorilor.

Rezultate prevăzute în proiect:
Proiectul va realiza o cohortă cu peste 100 de pacienți cu lupus eritematos sistemic (LES) și peste 100 de controale, pentru care vor fi colectate date clinice și probe biologice (ADN, ARN, PBMC, ser). Pe baza acestor materiale vor fi generate date genetice și transcriptomice de înaltă rezoluție, care vor permite identificarea variantelor genetice ce influențează răspunsul imun, în special activarea căii interferonului de tip I – element central în patogeneza lupusului.

Analizele experimentale se vor concentra pe celulele mononucleare din sânge (PBMC), stimulate ex vivo. Vor fi definite semnături moleculare specifice lupusului și vor fi cartografiate legături între varianta genetică și expresia genelor (eQTL / splice-QTL).

În paralel, pacienții tratați cu terapii biologice (Belimumab și Anifrolumab) vor fi urmăriți longitudinal, pentru a identifica biomarkeri genetici și transcriptomici care pot prezice răspunsul la tratament. Rezultatele vor contribui la o mai bună stratificare moleculară a pacienților și la posibile recomandări viitoare de medicină personalizată.

Datele obținute vor fi puse la dispoziția comunității științifice, împreună cu pipeline-uri bioinformatice standardizate. Proiectul va sprijini formarea unei echipe de cercetare competitive în România în domeniul multi-omics și imunologiei translațională.

Indicatori de realizare prevăzuti în proiect:

6 articole în reviste internaționale indexate publicate/acceptate spre publicare
cel putin 3 prezentari a rezultatelor la congrese și conferințe de specialitate (naționale și internaționale)
Studenți doctoranzi numar/echivalent normă întreagă angajați în cadrul proiectului- Nr.3/2 ENI
Post-doctoranzi numar/echivalent normă întreagă angajați în cadrul proiectului -Nr.5/2 ENI
Cercetători care lucrează în organizații de cercetare din România (centre de cercetare) care beneficiază de sprijin (echivalent normă întreagă) – (număr)- 4
Adoptarea Cartei Europene a cercetătorilor și a Codului de conduită pentru recrutarea cercetătorilor de către organizațiile de cercetare (număr entități CDI care au adoptat Carta și Codul)-1
1 Cerere de brevet – după finalizarea proiectului

Rezultate științifice obținute până la 30.06.2026 :

Până la data de 30.06.2026, proiectul a generat următoarele rezultate majore:

Constituirea unor cohorte care cuprind peste 100 de pacienți cu lupus eritematos sistemic și peste 100 de controale sănătoase.
Colectarea și biobancarea probelor de ADN, ARN, PBMC și ser, precum și a datelor clinice longitudinale.
Finalizarea genotipării pe platforma Illumina Global Screening Array v2.0 pentru 134 de pacienți cu LES și 108 controale sănătoase, urmată de un control cuprinzător al calității.
Finalizarea analizei splicingului alternativ, cu identificarea retenției intronilor și a săririi exonilor drept evenimente majore și demonstrarea unor modele asociate activității bolii și specifice tipurilor celulare.
Identificarea a 777 de asocieri splice-QTL semnificative și prioritizarea genelor implicate în răspunsul interferonic și în imunitate, inclusiv IRF7, MX1 și PILRB.
Finalizarea evaluării funcționale a variantei ERAP1 rs27039, fără dovezi privind un efect robust, reproductibil și dependent de genotip asupra citokinelor în testele efectuate.
Finalizarea experimentelor de stimulare ex vivo TLR7/TLR9 pentru 30 de pacienți cu LES și 30 de controale sănătoase.
Pregătirea și depozitarea probelor recoltate la șase ore în TRIzol pentru analiza transcriptomică și a supernatantelor recoltate la 24 de ore pentru cuantificarea IFN-α și IL-2.
Livrarea sistemului automat de imunodozare ELLA și a cartușelor pentru validarea ulterioară la nivel proteic.
Finalizarea genotipării și a experimentelor de stimulare ex vivo pentru cohortele terapeutice formate din 7 pacienți tratați cu Belimumab și 18 pacienți tratați cu Anifrolumab.
Dezvoltarea și aplicarea pipeline-urilor bioinformatice pentru analize genetice, transcriptomice, eQTL, splice-QTL, de expresie diferențială și de splicing alternativ

Livrabile tehnice:

A1.1: Raport tehnic care conține datele clinice și biologice ale pacienților cu LES recrutați.

A1.2: Raport tehnic privind controlul calității studiilor de secvențiere și genotipare.

A2.1.0: Raport tehnic care conține datele clinice și biologice ale pacienților cu LES și ale controalelor sănătoase recrutați.

A2.1: Raport tehnic privind izolarea și puritatea celulelor dendritice plasmacitoide (pDC), caracterizarea prin citometrie în flux și standardizarea protocoalelor de stimulare ex vivo.

A3.1: Raport tehnic care conține datele clinice și biologice ale pacienților cu LES recrutați care au inițiat tratamentul cu Belimumab.

A3.4: Raport tehnic: experimente ex vivo/in vitro care investighează interacțiunea dintre variația genetică, expunerea la interferon și blocarea BAFF.

A1.3: Raport tehnic și pipeline bioinformatic pentru detectarea evenimentelor de splicing alternativ în LES.

A1.4: Raport tehnic și pipeline bioinformatic pentru cartografierea eQTL și splice-QTL.

A1.6: Raport tehnic privind experimentele de validare funcțională ex vivo/in vitro.

A2.3: Raport tehnic privind controlul calității studiilor de genotipare.

A2.6: Raport tehnic privind validarea ex vivo/in vitro a mecanismelor care reglează producția interferonului de tip I.

A3.2: Raport tehnic privind controlul calității genotipării și al studiilor transcriptomice planificate pentru cohortele terapeutice.

A3.5: Raport tehnic privind experimentele ex vivo/in vitro în cohortele tratate cu Belimumab și Anifrolumab.

Stadiul la finalizarea proiectului:

La data de 30.06.2026, perioada de implementare a proiectului s-a incheiat, iar majoritatea activităților clinice, genetice, bioinformatice și experimentale ex vivo planificate fuseseră finalizate.

Analiza splicingului alternativ, genotiparea cohortelor principale de pacienți cu LES și controale sănătoase, cartografierea splice-QTL și evaluarea funcțională a ERAP1 rs27039 au fost finalizate.

Genotiparea și experimentele de stimulare ex vivo au fost, de asemenea, finalizate pentru cohortele terapeutice selectate, tratate cu Belimumab și Anifrolumab.

Sistemul automat de imunodozare ELLA și cartușele au fost livrate în iunie 2026. Determinările la nivel proteic vor fi efectuate după instruirea operatorilor, programată pentru 18 august 2026.

Procedura de achiziție a serviciilor de secvențiere ARN a fost anulată înainte de atribuirea contractului, deoarece nu a fost depusă nicio ofertă admisibilă. Prin urmare, analizele dependente de RNA-seq privind îmbogățirea căilor, regulatorii din amonte, eQTL-urile specifice tipurilor celulare și interacțiunile cu tratamentul nu au putut fi finalizate în cadrul proiectului.

Toate probele transcriptomice pregătite și supernatantele de cultură rămân depozitate în condiții corespunzătoare. Analizele restante vor fi continuate în funcție de obținerea unor finanțări suplimentare și a unor oportunități de colaborare.

1 articol Q2- IgG4-related prostatitis: expanding the spectrumof IgG4-related disease. A systematic review”, Pamfil C, et al. publicat in revista Clinical and Experimental Rheumatology, ISI, I.F. 3.3.

1 articol științific publicat “Upadacitinib-Induced Remission in Multicentric Reticulohistiocytosis: Expanding the Therapeutic Role of JAK Inhibition” publicat în revista International Journal of Molecular Sciences (Q1, Web of Science)

Articol acceptat pentru publicare(Q1, Web of Science):

Differentiating tuberculous and pyogenic spondylodiscitis: Part I. Epidemiology, clinical features, laboratory markers and tissue-based diagnosis – Diagnostics (Q1)
Website: https://www.mdpi.com/2075-4418/16/14/2243
PDF Version: https://www.mdpi.com/2075-4418/16/14/2243/pdf

Articol acceptat pentru publicare august 2026:

Differentiating Tuberculous and Pyogenic Spondylodiscitis: Part II. MRI/CT Features, Prediction Models, and the Role of PET/CT—A Narrative Review – Diagnostics (Q1).
https://www.mdpi.com/2075-4418/16/16/2540

Manuscrise aflate în recenzie la reviste Q1 :

Unraveling pathophysiological mechanisms underlying sex differences in rheumatoid arthritis – RMD Open (Q1)
Unravelling systemic inflammation in gout and CPPD disease: new insights into shared and distinct pathophysiological mechanisms – Annals of Rheumatic Diseases (Q1)
Kinase signaling dynamics underlies trained immunity induction by pathogen-derived stimuli – Nature Communications (Q1)
Coronary vasculitis in juvenile systemic lupus erythematosus: a systematic review of an under-recognised cause of myocardial injury in children– Lupus Science & Medicine (Q1);

Manuscrise aflate în curs de finalizare și care vor fi transmise către reviste Q1:

Increased cholesterol load underlies the interferon-mediated inflammatory phenotype of lupus monocytes
Circuitele imune moleculare în lupusul eritematos sistemic.

Indicatori realizați până la data de 30.06.2026:

2 articole Q1 în reviste internaționale indexate publicate/acceptate spre publicare

“Upadacitinib-Induced Remission in Multicentric Reticulohistiocytosis: Expanding the Therapeutic Role of JAK Inhibition” publicat în revista International Journal of Molecular Sciences (Q1, Web of Science)
https://www.mdpi.com/1422-0067/27/6/2898

Articol acceptat pentru publicare:

Differentiating tuberculous and pyogenic spondylodiscitis: Part I. Epidemiology, clinical features, laboratory markers and tissue-based diagnosis – Diagnostics (Q1)
Website: https://www.mdpi.com/2075-4418/16/14/2243
PDF Version: https://www.mdpi.com/2075-4418/16/14/2243/pdf

A fost acceptat pentru publicare in luna august 2026 si atricolul:

4 prezentari a rezultatelor la congrese și conferințe de specialitate (naționale și internaționale)

Au fost susținute prezentări în cadrul

Ziua Bolilor Rare 2026 (27-28 februarie 2026, Zalau)- “Semne si simptome de alarma pentru LES
Ziua Bolilor Rare 2026 (2 martie 2026, Bucuresti) – “Centrul de boli rare musculoscheletale autoimune si autoinflamatorii SCJU Cluj”
Experiența clinică în lupus (Cluj-Napoca, 12 martie) – “Postpartum SLE: flares, APS, children and the next pregnancy”
Experiența clinică în lupus (Cluj-Napoca, 12 martie) – „Glucocorticoizii în LES – soluție sau problemǎ?”
Participare conferința Boli Rare (Bucuresti, Romania, 7 Mai 2026) Pamfil Cristina, Damian Laura
Participare simpozion Behcet Disease: an Update (Cluj-Napoca, Romania, 6 Aprilie 2026) Pamfil Cristina
Participare la Conferinta EULAR 2026 Congress(Londra-Anglia, 2-7 Iunie 2026) Marian Anamaria
Participare la Conferinta European Human Genetics Conference(Goteburg-Suedia, 12-17 Iunie 2026), Danci Valentin
Participare la Conferinta Longevity Summit Dublin (Dublin-Irlanda, 23-77 Iunie 2026), Cabau Georgiana

Rezumate originale:

Behçet disease: an update (Cluj-Napoca, 6 aprilie) – „Neuro-Behçet disease presenting as a pseudotumoral brain lesion – a 3-year clinical evolution”
Behçet disease: an update, Cluj-Napoca, 6 aprilie) – „Difficult cases of Behcet’s syndrome and their differential diagnosis”
15th European Lupus Meeting (Lisabona, 4–7 martie) – „Cytokine production profile of peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus – preliminary data”
Participare la eveniment Experienta Clinica in Lupus (Cluj-Napoca, Romania, 12 martie 2026) Pamfil Cristina- Rezumat original

Studenți doctoranzi numar/echivalent normă întreagă angajați în cadrul proiectului- Nr.3/1,84 ENI
Post-doctoranzi numar/echivalent normă întreagă angajați în cadrul proiectului -Nr.7/1,70 ENI
Cercetători care lucrează în organizații de cercetare din România (centre de cercetare) care beneficiază de sprijin (echivalent normă întreagă) – (număr)- 4/1,30 ENI
Adoptarea Cartei Europene a cercetătorilor și a Codului de conduită pentru recrutarea cercetătorilor de către organizațiile de cercetare (număr entități CDI care au adoptat Carta și Codul)-1
HR Excellence in Research award 12/02/2025
https://euraxess.ec.europa.eu/hrexcellenceaward/awarded

Perspective și sustenabilitate

Proiectul contribuie la dezvoltarea unei infrastructuri clinice, biologice și bioinformatice pentru cercetarea multi-omics în lupusul eritematos sistemic. Rezultatele obținute până în prezent susțin continuarea analizelor genetice, transcriptomice și funcționale, cu scopul identificării unor biomarkeri moleculari asociați

la terapii biologice și stratificării pacienților în funcție de statusul interferon-high versus interferon-low.

Cererea de brevet prevăzută în proiect rămâne o direcție strategică de valorificare, dar va putea fi dezvoltată după finalizarea analizelor integrative și obținerea datelor transcriptomice necesare.

Obiectivul este identificarea unor semnături moleculare predictive ale răspunsului la Belimumab și Anifrolumab, cu potențial de aplicare în medicina personalizată a lupusului eritematos sistemic.

Pentru protejarea procesului de publicare științifică și a eventualelor demersuri de proprietate intelectuală, website-ul prezintă rezultate consolidate și informații agregate, fără includerea datelor brute sau a rezultatelor nepublicate aflate încă în proces de validare.

Echipa:

George Bertsias – Director proiect,
Leo A.B. Joosten – Cercetător cu experiență
Simona Rednic – Cercetător cu experiență
Laura Damian – Cercetător cu experiență
Cristina Pamfil – Cercetător post-doctorand
Tania Crisan – Cercetător post-doctorand
Ghib Linda-Jessica – Cercetător post-doctorand
Cabău Georgiana – Cercetător post-doctorand
Danci Valentin-Adrian – 1 Student doctorand
Ancuta Straton/ Sîrghii Ana – Student doctorand
Marian Anamaria – Student doctorand
Cabău Georgiana – Asistent de cercetare/Cercetător postdoctorand
Badii Oana Medeea – Tehnician 1
Moldovan Alin Iulian – Tehnician 2
Căprar Sidonia Carmen – Tehnician 3
Muresan Ximena Maria – Cercetător postdoctorand
Cucoreanu Ciprian – Cercetător postdoctorand
Moldovan Cristian Silviu – Cercetător postdoctorand
Uifalean Alina – Cercetător postdoctorand

PNRR. Finanțat de Uniunea Europeană – UrmătoareaGenerațieUE
Conținutul acestui material nu reprezintă în mod obligatoriu poziția oficială a Uniunii Europene sau a Guvernului României

https://mfe.gov.ro/pnrr | https://www.facebook.com/PNRROficial