Modele in vitro. Studiile pot fi efectuate pe linii celululare aderente, cât și suspensie, atât în condiții normale sau hipoxice. De asemenea, se pot dezvolta şi evalua prin diferite studii, culturi celulare 3D precum sferoizi, organoizi, co-culturi, etc.
Testele de evaluare a proliferării celulare, a viabilității celulare și a citotoxicității sunt utilizate în mod curent pentru a monitoriza efectul diferitelor tratamente.
Pentru răspunsul la diferite scenarii de tratament și în cazul în care se utilizează doze multiple, putem calcula parametrul toxicologic standard IC50 prin:
- MTT un test colorimetric pentru evaluarea activității metabolice a celulelor (utilizat pentru celule aderente);
- MTS este utilizat pentru a evalua proliferarea celulară, viabilitatea celulară și citotoxicitatea – specifică pentru celulele în suspensie;
- este foarte stabil și prezintă citotoxicitate mică. Timpul de incubare este mai lung (24 până la 48 de ore) – atât pentru celulele aderente, cât și pentru cele în suspensie.
Modificarile proceselor celulare și moleculare în celulele studiate pot fi evaluate cu ajutorul următoarelor teste funcționale:
- Evaluarea apoptozei folosind dublă colorare (TMRE/Hoechst pentru nucleu și potențial mitocondrial, respectiv Annexin-V/PI pentru nucleu și membrana celulară) prin microscopie cu fluorescență şi cu ajutorul cititorului automat de plăci CELIGO.
- Evaluarea autofagiei folosind monodansil cadaverina și iodura de propidiu pentru colorarea vacuolele autofagice, respectiv nucleul și evaluarea prin microscopie cu fluorescență şi cu ajutorul cititorului automat de plăci CELIGO.
- Testul de colonie (testul clonogenic) este considerat a fi standardul de aur pentru evaluarea răspunsului in vitro al celulelor la un compus terapeutic.
- Testul scratch (testul de vindecare a rănilor) este o tehnică standard in vitro pentru analiza migrării celulare. Se poate evalua prin microscopie confocală şi cu ajutorul cititorului automat de plăci CELIGO.
Citometrie în flux permite caracterizarea populațiilor de celule și măsoară simultan proprietățile optice inerente ale celulelor și ale anumitor fluorofori legați de anticorpi care s-au legat de celule. Cu ajutorul acestora, putem evalua:
- Apoptoza cu ajutorul colorației Annexin-V/PI pentru a identifica stadiile timpurii, târzii și necrotice ale procesului de moarte celulară.
- Ciclul celular cu ajutorul colorației cu iodură de propidiu pentru a analiza fazele subG0, G1, S, G2/M.
- Caracterizarea celulelor stem prin intermediul anticorpilor CD11b, CD29, CD34, CD44, CD45, CD73.
Exozomii, vezicule cu o dimensiune cuprinsă între 30-150 nm, pot fi izolați din diferite fluide biologice (medii de cultură celulară, plasmă, salivă, ser etc.). Aceste vezicule sunt entități remarcabile care înglobează molecule bioactive importante și pot fi utilizate ca potențiali biomarkeri pentru diagnosticare, prognostic și răspuns la terapie.
- Izolați prin ultracentrifugare
- Caracterizare fizică și moleculară: NanoSight NS300, Western Blot
- qRT-PCR, NGS
Testarea noilor compuși terapeutici este utilizată intensiv în laboratorul de culturi celulare. Compușii sunt selectați în funcție de o semnătură mutațională specifică și prin efectuarea mai multor teste funcționale (viabilitate celulară, modificări morfologice, migrație, invazie) pentru a evalua procesele celulare și moleculare importante.
